靶向嵌合体蛋白水解（PROTAC）技术代表了药物发现领域的突破性发展，利用泛素蛋白酶体系统特异性降解与疾病相关的蛋白质，多项目已进入临床开发。但针对CF和某些癌症，需开发靶向蛋白稳定剂TPS以对抗异常蛋白降解。
靶向蛋白质稳定技术（targeted protein stabilization，TPS）是近年来生物医学领域一种新兴的技术，旨在通过特定的方法来稳定细胞内的蛋白质，从而影响其功能和行为。这种技术潜在应用广泛，从基础研究到新药开发都有重要价值。
去泛素化酶靶向嵌合体（deubiquitinase-targeting chimeras，DUBTACs）是近年来逐渐发展的一种靶向蛋白质稳定技术，DUBTACs一般由靶蛋白配体、去泛素化酶配体和Linker三部分组成，这样的结构设计使得DUBTAC分子可以同时结合靶蛋白和去泛素化酶，诱导靶蛋白和去泛素化酶靠近，去除靶蛋白上的泛素链，从而达到稳定以泛素化依赖方式降解的特定蛋白质的水平（图1）。
图1. DUBTAC平台
在这里，我们总结了近年来DUBTAC技术的研发进展，详细探讨了其在生物医药领域的应用前景和潜在挑战。
在2022年初，加州大学伯克利分校的Daniel K. Nomura教授团队运用基于活性的蛋白质图谱分析（activity-based protein profiling, ABPP）对65种去泛素化酶的反应性半胱氨酸进行全局性分析。研究结果发现，泛素化酶OTUB1的C23位点不参与酶活性的调控且具有较高的亲核性，是一个理想的配体结合位点。由于细胞中主要介导蛋白质降解的最丰富的泛素链是K48链，而OTUB1则是靶向移除K48链的去泛素化酶。理论上，利用OTUB1去针对性地去除特定蛋白上的泛素链，防止以泛素化依赖方式被降解的特定蛋白质被蛋白酶体降解，是非常有效的。Daniel K. Nomura教授团队基于上述发现筛选出了一个与OUTB1高亲和力结合的共价配体EN523（图2）。其中，EN523与OTUB1结合是通过EN523的丙烯酰胺部分与OTUB1变构半胱氨酸残基Cys23共价作用来实现的。他们通过体外实验证明EN523对OTUB1的酶活性没有显著影响。随后，研究人员将筛选到的EN523与ΔF508-CFTR调节剂Lumacaftor连接起来所获得的异源双功能小分子NJH-2-057用于靶向CFTR突变体ΔF508-CFTR的稳定从而改善囊性纤维化。实验结果表明，NJH-2-057可以有效稳定ΔF508-CFTR，而单独使用Lumacaftor的结果则与对照组差异不明显（图3）。这一结果为DUBTAC技术的发展提供了概念验证。Daniel K. Nomura教授团队随后将DUBTAC技术应用于提高抑癌基因WEE1的稳定性，WEE1是一种非恶性真核体细胞中的肿瘤抑制激酶，可磷酸化细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK1）-细胞周期蛋白B1复合物，以抑制有丝分裂S期和G2期的细胞周期进展，并且必须下调其活性才能发生有丝分裂进展。WEE1在许多肿瘤中被降解以促进癌细胞增殖。稳定癌细胞中WEE1激酶的水平有望阻止肿瘤生长。研究人员将EN523与一种临床WEE1抑制剂AZD1775通过烷基链linker或基于聚乙二醇的linker连接合成了靶向肿瘤抑制性激酶WEE1的DUBTAC。研究显示，DUBTAC能显著稳定肝癌细胞系中的WEE1，而EN523或AZD1775单独治疗对WEE1水平没有影响（图4）。这进一步证明了DUBTAC技术用于TPS的普适性，此外，Daniel K. Nomura教授团队的研究也强调了使用化学蛋白质组学支持的共价配体发现平台的实用性。2022年6月份，来自美国哈佛医学院的Wenyi Wei教授团队在此前研究的基础上，使用EN523招募去泛化素酶OTUB1进一步开发了能够稳定抑癌转录因子（Transcription Factor，TF）的首个TF-DUBTAC药物平台，旨在通过稳定TF实现对肿瘤的治疗（图5）。研究人员分别将FOXO3A、p53、IRF3三种转录因子的结合配体叠氮基修饰DNA寡核苷酸与BCN（bicyclononyne）修饰的去泛素化酶OUTB1的共价配体（DUBL-X-BCN 1-10）通过SPAAC反应连接起来，设计合成出了一系列靶向FOXO3A、p53、IRF3三种转录因子的DUBTAC分子（图6），紧接着，研究人员通过体外实验测定了细胞水平上化合物对靶蛋白的稳定作用，并筛选出有效的TF-TUBTAC分子，细胞水平活性测试研究表明，相应的TF-DUBTAC 以OUTB1依赖的方式分别稳定了细胞内的FOXO3A、p53、IRF3。这进一步说明了TF-DUBTAC是一个可推广的平台，可实现抑癌转录因子的选择稳定性，可作为抑制肿瘤生成的治疗手段。同时也表明DUBTAC技术在癌症治疗方面的普适性和有效性。由于基于去泛素化酶OTUB1共价配体开发出的DUBTACs可能与其他共价抑制剂类似存在毒性或超敏反应等劣势，因此，开发基于其他去泛素酶的可逆招募配体是TPS领域的重要发展方向。2024年4月份，美国哈佛医学院的Wenyi Wei教授团队开发了第一个基于去泛素化酶USP7的DUBTAC，其利用USP7的非共价配体实现了选择性稳定CFTR和AMPK蛋白的目的（图7）。首先，研究人员选择先前报道过的USP7 ligand #1作为去泛素化酶USP7的配体，通过分析配体与USP7复合物的共晶结构，选择配体分子USP7i-#4a结构中位于结合口袋外的氨基作为linker连接位点进行分子设计。研究人员将USP7 ligand#1与ΔF508-CFTR调节剂Lumacaftor通过linker连接合成了一系列的靶向CFTR的DUBTAC的分子，并在细胞水平上测定化合物对CFTR蛋白的稳定作用（图8）。研究结果表明，化合物MS6869以相对特定的方式促进了CFTR的稳定，其有效性与先前报道的基于OTUB1的CFTR-DUBTAC相当。随后，研究人员基于两种不同的USP7配体设计并合成了一系列的靶向AMPK的DUBTAC分子（图8），并对这些化合物进行AMPK蛋白稳定作用测试，研究表明，不同的USP7配体衍生的AMPK-DUBTAC可以选择性地稳定AMPK β的不同亚型，导致AMPK信号转导升高。这些结果无一不说明了基于USP7的DUBTAC技术开发的可行性。DUBTAC技术的出现，使得许多领域有望从主动泛素化和降解蛋白的靶向去泛素化中获益。例如稳定线粒体中的BAX水平以诱导细胞凋亡，稳定STING用于免疫肿瘤学应用或在胰腺细胞中稳定葡萄糖激酶用于成年发病型糖尿病2型。其他受益于DUBTAC的靶标包括各种为了维持癌细胞增殖而被主动泛素化和降解的肿瘤抑制因子。除了囊性纤维化之外，还有许多其他遗传疾病也可以通过dubtac稳定获益。包括高雪氏病或帕金森病中的葡萄糖脑苷脂酶突变和苯丙酮尿症中的苯丙氨酸羟化酶和富马酰乙酰乙酸羟化酶突变等。我们总结了近年来DUBTAC技术的研究进展，展现了DUBTAC技术在提高蛋白质稳定效率方面的显著优势，我们也对DUBTAC技术的发展前景做出了展望，期待更多研究者能够加入这一创新领域，共同推动生物医药技术的发展。DUBTAC通过稳定关键蛋白质来对抗疾病，如CFTR和WEE1，已在实验室研究中取得初步成功。随着技术的不断进步，基于USP7等其他去泛素酶的DUBTAC也在开发中，有望克服现有技术的局限性。展望未来，DUBTAC技术有望在更多领域发挥作用，为治疗各种疾病提供新的策略。
参考文献
[1]Deubiquitinase-targeting chimeras for targeted protein stabilization
[2]TF-DUBTACs Stabilize Tumor Suppressor Transcription Factors
[3]USP7-Based Deubiquitinase-Targeting Chimeras Stabilize AMPK
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